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Rispetto ad altri mammiferi, noi esseri umani abbiamo una fertilità particolarmente bassa. A ogni ciclo mestruale della donna, infatti, una coppia al massimo della capacità riproduttiva ha una probabilità di concepire che tocca appena il 30 per cento. Questa percentuale si riduce significativamente con l'aumentare dell'età della donna: oltre i 35 anni non supera il 20 per cento e diminuisce fino al 10 per cento oltre i 40. Non deve sorprendere, quindi, che si debbano spesso attendere alcuni mesi prima di vedere coronato il desiderio di concepire un figlio. Se però l’incapacità di procreare si protrae ininterrottamente per due anni, è possibile che uno o entrambi i partner siano infertili. In questo caso può essere utile ricorrere a un centro specializzato nella cura dell'infertilità, anche perché la compromissione della capacità riproduttiva, oltre a costituire un ovvio problema di carattere medico, tocca aspetti altrettanto complessi di natura psicologica e sociale.

L'infertilità, sia maschile sia femminile, è un problema di consistenti proporzioni. Si stima infatti che il 15 per cento delle coppie in età fertile abbia severe disfunzioni riproduttive, e che un ulteriore 10 per cento soffra di patologie di gravità più modesta. Per quanto riguarda l’Italia, nonostante non siano disponibili dati epidemiologici esaurienti, è indubbio che l'infertilità affligge decine di migliaia di persone.

Alcune delle disfunzioni riproduttive hanno un’origine genetica, mentre altre sono riconducibili a cause ambientali.

TABELLA. Il contributo di diversi fattori all’infertilità

Recenti studi suggeriscono che l'infertilità maschile e femminile sia in forte aumento. Gli attuali stili di vita giocano certamente a sfavore della funzione riproduttiva. Ai nostri giorni, infatti, per ragioni sociali e professionali molte donne pospongono l'esperienza del concepimento a una età in cui la loro fertilità è sensibilmente ridotta (non a caso, molte delle coppie che si rivolgono a un centro per la cura dell'infertilità sono in età riproduttiva avanzata). Per quanto riguarda gli uomini, invece, le caratteristiche del seme sono progressivamente peggiorate nel corso degli anni, almeno in alcune popolazioni. Fattori ambientali come l'inquinamento possono essere in parte responsabili della aumentata incidenza dell'infertilità maschile e femminile; è però difficile in molti casi risalire a specifiche cause per l'estrema varietà di agenti a cui siamo esposti quotidianamente.

L'infertilità maschile può avere origine da disfunzioni correlate alla produzione, all’emissione o alla funzionalità degli spermatozoi, le cellule sessuali maschili.

L'anamnesi
Il primo passo per identificare la causa di uno stato di infertilità consiste nel raccogliere informazioni sulla storia medica del paziente, indagando su eventuali infezioni uro-genitali, malattie come varicella, morbillo o parotite, a trasmissione sessuale, oppure affezioni croniche, come il diabete e l'ipertensione arteriosa. Possono avere rilevanza anche gli interventi chirurgici o i traumi a livello genitale, le abitudini sessuali (uso di profilattici o spermicidi, frequenza dei rapporti, disfunzioni sessuali) e i regimi di vita (per esempio riguardo all’assunzione di alcool, fumo e droghe, o al tipo di lavoro svolto).
 
L'indagine diagnostica
L'esame del liquido seminale (o spermiogramma) è uno strumento diagnostico attraverso cui è possibile valutare le principali caratteristiche dell'eiaculato. Oltre alle proprietà chimico-fisiche (volume, pH, fluidificazione e viscosità), si esaminano concentrazione, motilità e morfologia degli spermatozoi presenti nel campione; i parametri vengono poi confrontati con gli standard di normospermia dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (Oms). Particolare attenzione viene posta anche nella valutazione qualitativa e quantitativa del resto della popolazione cellulare (cellule del sangue, epiteliali dei dotti delle vie genitali, germinali e globuli bianchi), utile per descrivere completamente il campione seminale in tutti i suoi aspetti. A seguito dell'esito dello spermiogramma, possono essere richiesti ulteriori esami, quali:
 
Esame microbiologico del liquido seminale per valutare la presenza qualitativa e quantitativa di particolari microrganismi (batteri e miceti) che svolgono un ruolo in alcuni quadri patologici dell'apparato genitale nel suo complesso. L'isolamento dell'eventuale ceppo patogeno è seguito da un arricchimento in coltura e dal successivo antibiogramma, allo scopo di individuare e disegnare un trattamento antibiotico ad hoc.
 
Dosaggi degli ormoni luteinizzante (LH), follicolo-stimolante (FSH), prolattina (PRL) e testosterone (T), i cui livelli, se alterati, possono influire sul processo di produzione degli spermatozoi.
 
Ecografia della prostata e del testicolo, per evidenziare eventuali anomalie anatomico-funzionali.
 
Esame citologico testicolare per aspirazione o esplorazione chirurgica, consigliabile nei casi in cui lo spermiogramma (o un successivo trattamento di centrifugazione su gradiente discontinuo) non sia in grado di rilevare la presenza di spermatozoi nell'eiaculato. Questa metodica permette di isolare minime frazioni di tessuto direttamente dai vari distretti testicolari (polo superiore, medio, inferiore ed epididimo), e di analizzarli per confermare o meno un eventuale esito di azoospermia (assenza di spermatozoi).
 
Immunobead test (IBT) ed altri test immunologici miranti ad accertare l’eventuale presenza di anticorpi sulla superficie degli spermatozoi che possono potenzialmente interferire con il loro trasporto attraverso le vie genitali femminili o con il processo di fertilizzazione. Nella donna, anticorpi anti-spermatozoo possono essere evidenziati anche nelle secrezioni delle vie genitali (per esempio nel muco cervicale) e nel sangue.
 
Integrità del DNA spermatico (tunel assay) per individuare anomalie nell'organizzazione della cromatina (la sostanza che forma il DNA). Spermatozoi con parametri nella norma ma con anomalie nel genoma (per esempio con frammentazione del DNA), infatti, difficilmente portano a un concepimento. Per questo, disporre di un sistema in grado di testare l'integrità genomica appare ormai indispensabile per valutare la reale qualità del seme. Il Tunel Assay è la tecnica diretta di rilevazione di danno a carico del genoma nucleare che evidenzia e quantifica, all’interno di una popolazione complessiva di spermatozoi, quelli caratterizzati da DNA frammentato.
I risultati di questo test, insieme a quelli dello spermiogramma possono contribuire a scoprire le reali cause di subfertilità e infertilità maschile, con lo scopo di proporre protocolli terapeutici mirati.
 
F.I.S.H. Test o “valutazione dell’assetto cromosomico nemaspermico”, per stimare la percentuale di spermatozoi con anomalie numeriche - aneuploidie e diploidie - per i cromosomi 13, 18, 21, X e Y. Per  “aneuploidia” si intende una condizione per cui la cellula spermatica non possiede più il corretto numero di 23 cromosomi (assetto aploide), e si verifica pertanto una condizione di disomia (23 cromosomi +1) o di nullisomia (23 cromosomi –1); con “diploidia” si indica la presenza di due coppie di tutti i cromosomi analizzati. La valutazione viene eseguita in microscopia a fluorescenza (F.I.S.H sta per Fluorescence In-Situ Hybridization), utilizzando sonde di DNA specifiche per i cromosomi 13, 18, 21, X e Y: nel caso dei cromosomi 13, 18, 21, le rispettive trisomie (doppia copia dello stesso cromosoma) sono tra le possibili anomalie che si riscontrano nelle progenie a seguito dell'ICSI, e sono compatibili con la sopravvivenza; i cromosomi sessuali X e Y, invece, sono tra quelli che riportano le frequenze più elevate di aneuploidia in pazienti infertili e, di conseguenza, sono quelli più a rischio di trasmissione nelle progenie.

Le più importanti cause di infertilità femminile derivano da disfunzioni ormonali della follicologenesi e dell'ovulazione, da imperfezioni anatomico-funzionali che impediscono il passaggio delle cellule sessuali e dell’embrione attraverso le tube, o dall'incapacità dell'utero di accogliere l’embrione in via di sviluppo. Come nel caso dell'infertilità maschile, il primo passo da compiere consiste nel raccogliere informazioni sulla storia clinica della paziente (anamnesi).
 


Indagini sulla follicologenesi e sull'ovulazione
In condizioni normali, a ogni ciclo mestruale una singola cellula sessuale femminile (ovocita) viene ovulata dopo aver acquisito la piena maturità durante il processo di follicologenesi. La buona riuscita di questo processo dipende principalmente dall'azione coordinata di tre ormoni: l’FSH, che promuove la crescita dei follicoli, particolarmente all'inizio del ciclo, l’LH, che coopera con l’FSH nella stimolazione della crescita follicolare e che innesca l'ovulazione e l’estradiolo, che contribuisce alla regolazione dell'attività degli altri due ormoni.
 


Accertamento dell’ovulazione. Il “metodo della temperatura basale” è l’approccio più semplice per accertarsi che l'ovulazione si verifichi effettivamente; consiste nell’osservazione di caratteristiche variazioni della temperatura corporea in diverse fasi del ciclo. Tale metodo è però tutt’altro che affidabile, in quanto impreciso e soggetto a errori di misurazione.
 Maggiore precisione si ha con i dosaggi ormonali con cui si misurano i livelli di FSH, LH, degli estrogeni e di altri ormoni - come la prolattina, gli ormoni tiroidei e androgeni - che possono influire sul meccanismo dell'ovulazione e determinare condizioni di infertilità e sterilità femminile.
 


Valutazione della riserva ovarica. Per misurare il volume delle ovaie e la stima dei follicoli antrali presenti in ciascun ovaio si eseguono i dosaggi di tre ormoni presenti nel sangue (FSH, prodotto dall’ipofisi, e Inibina B e AMH, prodotti dalle ovaie) e un’ecografia pelvica transvaginale. La valutazione della riserva ovarica deve essere eseguita tra il secondo e il quinto giorno dall’inizio del ciclo mestruale.
 L’Inibina B e l’AMH si riducono con l’approssimarsi della menopausa, mentre l’FSH aumenta.
 La misura del livello degli ormoni, associata alla conta follicolare antrale (AFC) e al calcolo del volume ovarico mediante ecografia in fase follicolare precoce del ciclo, consentono di stimare la risposta ovarica alla stimolazione farmacologica con gonadotropine durante i trattamenti di procreazione assistita.

Indagini anatomiche

La tuba esercita una funzione essenziale di trasporto e di nutrizione delle cellule sessuali e dell'embrione; in entrambi i casi è indispensabile l'integrità del rivestimento interno della tuba (la mucosa) e del suo apparato muscolare. Queste delicate funzioni, infatti, possono essere influenzate negativamente dalla presenza di una alterazione della mucosa. Cause frequenti sono l'endometriosi e le infezioni pelviche acute o croniche, spesso dovute a malattie sessualmente trasmesse o a interventi chirurgici. Gli esami di accertamento sono:
 


La sonoisterografia, un esame ecografico indolore che permette lo studio accurato della cavità endometriale. Viene eseguito con l’utilizzo di un sottile catetere sterile monouso posizionato all’interno del canale cervicale. Il catetere serve per iniettare nella cavità uterina alcuni millilitri di soluzione fisiologica (acqua sterile) che consente, mediante ecografia transvaginale, di visualizzare eventuali patologie presenti all’interno della cavità (polipi endometriali, miomi uterini sottomucosi, setti uterini). L’esame dura mediamente 15-20 minuti e consente di evitare indagini diagnostiche più invasive e dolorose come l’isteroscopia. È consigliabile effettuare la sonoisterografia nei primi giorni dopo la cessazione delle mestruazioni.
 


L'isterosalpingografia, un esame contrastografico che consiste nell'opacizzazione della cavità uterina e delle tube mediante l'introduzione di un mezzo di contrasto radiopaco. L'esame consente di diagnosticare le malformazioni uterine, di evidenziare sinechie, polipi e fibromi e di verificare la pervietà tubarica. L’esame non permette invece la valutazione dell'integrità fisiologica tubarica.
 


La sonoisterosalpingografia, un esame contrastografico che non richiede l'uso di un mezzo di contrasto radiopaco né di radiografie. Attraverso un sottile catetere introdotto nel canale cervicale, una piccola quantità di soluzione fisiologica viene iniettata nell’utero; poi, grazie a una sonda ecografica transvaginale si osserva se il liquido fuoriesce dalle tube o meno. Oltre alla pervietà tubarica è possibile valutare anche la presenza di polipi, miomi e patologie uterine endocavitarie.
 


Ecografia 3D e 4D consente di ottenere immagini dell’utero statiche in un caso, e in movimento in tempo reale nell’altro, così da visualizzare e valutare eventuali malformazioni.
 L’ecografia standard (bidimensionale) fornisce immagini in sezione delle strutture anatomiche e le restituisce in differenti tonalità di grigio. Con le metodiche 3D e 4D, invece, l’ecografo memorizza un certo numero di sezioni ed effettua il cosiddetto “rendering”, che consente di ottenere un’immagine tridimensionale estremamente accurata delle strutture anatomiche che si stanno visualizzando. In campo ginecologico, l’utilizzo dell’ecografia 3D e 4D evita spesso di dover ricorrere a indagini diagnostiche più invasive, come l'isteroscopia.
 


L'isteroscopia, utilizzata per l'esame della cavità uterina, prevede il passaggio di un piccolo strumento a fibre ottiche (l'isteroscopio) attraverso il canale cervicale fino a visualizzare l'intera cavità. È l’esame più affidabile per la valutazione delle patologie endocavitarie come miomi, polipi, setti completi e anche subsetti che non sempre sono evidenziati dalle altre metodiche diagnostiche.
 


La laparoscopia, un esame visivo dell'anatomia della tuba che mostra anche la sua posizione rispetto all'ovaio e permette l'identificazione di aderenze e di altre alterazioni morfo-funzionali della cavità peritoneale che potrebbero causare l’infertilità. Viene eseguita inserendo una sonda ottica nella cavità peritoneale attraverso una piccola incisione praticata nella parete addominale. Una volta ispezionati gli organi riproduttivi, un liquido di contrasto può essere iniettato attraverso il canale cervicale per osservarne il passaggio attraverso le tube. 
Diversamente dagli altri esami descritti, la laparoscopia richiede un ricovero di 1-2 giorni e l'anestesia generale. Spesso la laparoscopia viene associata all'isteroscopia per ottenere un quadro completo dell'apparato genitale.

I rischi per la paziente
La sindrome da iperstimolazione ovarica rappresenta la principale complicazione della fase di stimolazione ovarica. Le cause alle origini della sua insorgenza non sono ancora del tutto conosciute. Può presentarsi in forme più o meno gravi. La forma lieve interessa una parte significativa di pazienti (8-20%) e comporta distensione addominale, nausea e ingrossamento delle ovaie. In genere questa forma non richiede ospedalizzazione e si risolve spontaneamente. La forma più grave interessa un'esigua minoranza delle pazienti (circa lo 0,6%) e si presenta con dolori addominali, ascite, concentrazione di elettroliti nel sangue e ipercoagulabilità ematica. Le complicazioni di questa forma possono essere serie, per questo è necessario il ricovero ospedaliero e un attento monitoraggio di diversi parametri.

I rischi operatori legati al prelievo di ovociti per via transvaginale sono percentualmente molto bassi e comprendono infezioni pelviche (0,8%) e sanguinamento addominale (0,07%). I rischi di complicazioni emorragiche o lesioni degli organi addominali in seguito a interventi laparoscopici sono percentualmente modesti (3%). Non esistono rischi anestesiologici specifici delle metodiche di fecondazione assistita; questi rischi non vanno comunque trascurati e richiedono un’adeguata valutazione preliminare.

Alcuni studi suggeriscono che l'incidenza di aborto spontaneo nel corso di gravidanze ottenute tramite trattamenti di fecondazione assistita sia superiore rispetto a quella registrata nelle gravidanze spontanee. Più che indicare un rischio specifico però, i dati indicano più verosimilmente che le pazienti ricorse alla Pma sono interessate da condizioni che predispongono all’aborto, come un’età elevata.

Le gravidanze ectopiche
Nei concepimenti naturali, ma anche in conseguenza di un trattamento FIVET, si possono verificare, con una frequenza di circa il 2-3 per cento, gravidanze ectopiche, in cui uno o più embrioni si impiantano in una sede diversa dall'utero. Molto meno frequenti sono invece le gravidanze eterotopiche, ossia quelle in cui due o più embrioni si impiantano contemporaneamente sia nell'utero sia in un’altra sede; si tratta di una condizione che merita particolare attenzione perché può essere non rilevata. L'impianto in sede ectopica, oltre a non essere compatibile con un normale sviluppo del feto, costituisce un rischio anche per la madre, perché comporta complicazioni emorragiche. Comunque, nelle pazienti sottoposte a trattamenti di fecondazione assistita, le gravidanze ectopiche di regola sono individuate precocemente, prima dell'insorgenza delle eventuali complicazioni.

I rischi per il feto
La procreazione assistita deve costantemente confrontarsi con la ricerca del delicato equilibrio tra la tendenza a trasferire più embrioni allo scopo di garantire alte percentuali di gravidanza, e la opposta necessità di non trasferirne “troppi”, per minimizzare i rischi di gravidanze multiple. È importante che il medico tenti di evitare le gravidanze trigemellari, dal momento che spesso si risolvono in parti molto prematuri, comportando una serie di gravi conseguenze per il neonato e complicazioni ostetriche per la madre. Purtroppo, allo stato attuale non è possibile stabilire con assoluta certezza la capacità di sviluppo di ogni singolo embrione; di conseguenza, in tutti quei casi in cui viene adottata la scelta di trasferire più di un embrione, il rischio di gravidanze multiple rimane inevitabile.
Diversi studi indicano che complessivamente i bambini nati da trattamenti FIVET hanno alla nascita un peso inferiore alla norma e vengono partoriti dopo una gravidanza pretermine. Questo risultato è fortemente influenzato dall'esito ostetrico delle gravidanze multiple. Va però notato che, per cause da attribuirsi forse alla stessa condizione di infertilità, questo fenomeno si verifica anche nelle gravidanze singole, sebbene in misura sensibilmente inferiore.

La menopausa è precoce quando si presenta prima dei 40 anni. A volte si manifesta spontaneamente, ed è questo un problema che colpisce l’1 per cento delle donne italiane. In un altro 4-5 per cento dei casi, invece, l’esaurimento ovarico precoce colpisce donne che si sono sottoposte a chemioterapia o radioterapia, oppure a chirurgia pelvica, in particolar modo chirurgia ovarica, come interventi di asportazione di cisti, di endometriomi, o cisti dermoidi bilaterali (in questi casi la menopausa si dice “iatrogena”).
 
Le cause della sindrome della menopausa precoce
Spesso la causa che determina un esaurimento ovarico precoce rimane sconosciuta.
Quando è possibile determinarla, questa è di solito riconducibile:

- a malattie genetiche (Sindrome di Turner, Sindrome di Swyer, Sindrome di insensibilità androgena associata a Sindrome del cromosoma X fragile);
- a difetti enzimatici/metabolici ereditari (Galattosemia, Talassemia Maior trattata con emotrasfusioni multiple, Emocromatosi);
- a chemioterapia e/o radioterapia pelvica neoadiuvanti e adiuvanti (una dose radioterapica da 500 a 800 rads determina una menopausa precoce nel 60-70% delle pazienti tra i 15 e i 40 anni, mentre dosi superiori a 800 rads a livello pelvico causano un esaurimento ovarico precoce irreversibile nella quasi totalità delle pazienti);
- a terapie con Interferone (Sclerosi Multipla);
- a interventi di chirurgia pelvica (la menopausa chirurgica è la forma di menopausa iatrogena più frequente, e si verifica soprattutto in caso di chirurgia ovarica in particolar modo per endometriosi bilaterale);
- a infezioni virali (parotite, tubercolosi,...);
- a secrezione o azione anomala delle gonadotropine (FSH ed LH, ormoni ipofisari che hanno come organo bersaglio le ovaie);
- a malattie autoimmunitarie (disfunzione della tiroide e polighiandolare di I e II tipo, ipoparatiroidismo, artrite reumatoide, diabete IDDM, anemia perniciosa, porpora trombocitopenica idiopatica, vitiligine, lupus sistemico eritematoso, Morbo di Addison).

La diagnosi di menopausa precoce idiopatica (cioè apparentemente inspiegabile) viene formulata per esclusione delle cause elencate in precedenza, e oltre l’80 per cento dei casi della sindrome si colloca in questo gruppo. Il fatto che nel 30 per cento dei casi queste pazienti riferiscano una storia familiare simile lascia supporre che alla base ci sia un fattore genetico ereditario.
 
La diagnosi
La menopausa precoce non è necessariamente una condizione irreversibile: in letteratura sono riportati casi di ripresa spontanea della funzionalità ovarica e/o l’instaurarsi di una gravidanza. Livelli elevati di FSH (ormone prodotto dall’ipofisi, che determina la crescita dei follicoli a livello delle ovaie) non indicano in modo definitivo il completo esaurimento ovarico. Infatti, in circa il 20 per cento delle pazienti affette da menopausa precoce è possibile evidenziare un’ovulazione, anche dopo cinque anni dalla diagnosi.

Un valore dell’FSH superiore a 30 UI/l, significa che l’ovaio fa più fatica a rispondere agli stimoli ormonali, e che quindi la menopausa non tarderà a manifestarsi in un arco variabile di tempo da pochi mesi a un anno o due al massimo; in questo arco di tempo si verificano brevi intervalli in cui esiste una produzione ormonale irregolare prima che l’attività ovarica cessi completamente.
L’esecuzione di almeno due prelievi per il dosaggio dell’FSH ha valore diagnostico se i dati sono in ambedue i casi superiori a 40 UI/l, e la paziente è in amenorrea da almeno sei mesi. Se l’estradiolo è superiore a 50 pg/ml (range che definisce la postmenopausa) e il rapporto FSH/LH (espressione dell’attività ovarica) è inferiore a 1, è possibile monitorare la crescita follicolare spontanea attraverso ecografie pelviche TV, o tentare un trattamento con gonadotropine esogene.

Un dosaggio dell’estradiolo inferiore a 30 pg/ml dice che difficilmente si riavrà una ricomparsa del flusso mestruale, mentre sotto i 20 pg/ml significa che l’ovaio ha esaurito le scorte di follicoli, e produce estrogeni in maniera ormai residuale.

L’esaurimento ovarico precoce è anche associato a una riduzione dell’ormone surrenalico DHEA (Diidroepiandrosterone). Questo ormone si riduce in maniera proporzionale all’età: del 2% all’anno dopo i 30 anni, con un’ulteriore riduzione del 50-60% quando cessa l’attività ovarica in perimenopausa, in quella fase variabile di tempo che precede l’evento menopausale vero e proprio, ossia la definitiva scomparsa del ciclo mestruale.

Si può fermare l'orologio biologico?
Nella nostra specie la fertilità è una finestra che si apre presto nel corso della vita e che altrettanto presto si richiude. Se questo non bastasse, si può anche chiudere in anticipo per molte ragioni note, come malattie e interventi chirurgici, o per ragioni che restano sconosciute. La possibilità di congelare e conservare per lungo tempo i gameti femminili, le uova, è piuttosto recente e ancora relativamente sperimentale, ma può consentire di avviare in un secondo momento un percorso riproduttivo a quelle donne che sanno che la propria finestra sta per chiudersi precocemente.

Nel cosiddetto mondo industrializzato, di cui l’Italia fa parte, viviamo in società altamente contraddittorie: da un lato si fanno pochi figli (e l’Italia in questo caso detiene un non invidiabile primato, con appena 1,3 figli per donna), dall’altro per molte coppie esistono seri problemi di fertilità (una coppia su cinque nel nostro paese).
Non c’è alcun dubbio che oggi anche in Italia le donne siano impegnate fortemente nella propria realizzazione professionale. Procedere in questa strada porta con sé le ovvie conseguenze di spostare nel tempo il progetto di formare una famiglia. Sempre più spesso, infattti, solo quando il percorso professionale è avviato e consolidato ci si può permettere il “lusso” di desiderare dei figli. Ma l’apice della capacità procreativa si raggiunge intorno ai vent’anni, poi tale capacità comincia inesorabilmente a diminuire: così quando arriva il momento socialmente più adatto per avere figli, arriva anche la “punizione biologica” e ci si accorge che il progetto non si può realizzare come era stato pensato e desiderato. È difficile dire se costruire una famiglia e mettere al mondo dei figli sia un vero e proprio diritto, ma è certamente vero che la procreazione è un aspetto fondamentale della vita e certamente un corollario della libertà di espressione delle persone e delle coppie.

Congelare i propri gameti - cioè le uova (ovociti) e gli spermatozoi - può diventare una concreta possibilità per rallentare l’orologio biologico e per proteggere il proprio potenziale riproduttivo dai rischi che alcune terapie, particolari interventi chirurgici e alcune malattie comportano.

Nel nostro paese, le tecniche di congelamento degli ovociti hanno ricevuto grande attenzione dai laboratori di ricerca e dai centri di procreazione assistita, in particolar modo a seguito dell’entrata in vigore della legge 40 del 2004 che limitava fortemente i casi in cui era concesso ricorrere al congelamento degli embrioni. Tecnobios Procreazione lavora in questo specifico settore dalla seconda metà degli anni Novanta ed è, in Italia e nel mondo, uno dei centri che può vantare la più ampia esperienza in materia.

Tre buone ragioni per congelare i propri ovociti
Esistono almeno tre buone ragioni per cui una donna può desiderare di congelare i propri ovociti: perché deve sottoporsi a radioterapie o a chemioterapie che la renderanno sterile; perché sa di avviarsi prima del tempo, per diversi motivi, a un esaurimento ovarico (menopausa precoce) e vuole conservare il proprio potenziale riproduttivo per usarlo successivamente; perché desidera semplicemente spostare nel tempo la propria maternità, conservando le migliori possibilità di successo.
 
Sono passati quasi venti anni dall’annuncio della prima gravidanza ottenuta da ovociti congelati. Nel decennio che ha seguito questo successo, sono stati pochissimi i bambini nati con questa tecnica, che quindi è stata progressivamente abbandonata. Solo dopo altri dieci anni è stata annunciata un’altra gravidanza ottenuta con ovociti scongelati grazie alla tecnica ICSI (Porcu, E et al., 1997). La nuova metodologia di inseminazione, infatti, ha permesso di superare la difficoltà degli spermatozoi di penetrare la zona pellucida degli ovociti scongelati. Da quel momento, da ovociti congelati sono nati in Italia circa 200 bambini. In particolare, dopo l’introduzione della Legge 40 ed il conseguente divieto del congelamento degli embrioni, il numero di pazienti che richiede la crioconservazione degli ovociti è notevolmente aumentato. Questo ha portato a un costante miglioramento dei risultati, senza contare che il congelamento degli ovociti dà alle donne le stesse opportunità di preservare la fertilità che gli uomini hanno da decenni.

Dalla crioconservazione degli embrioni alla crioconservazione degli ovociti
Nella normale prassi della PMA, la crioconservazione degli embrioni soprannumerari e il loro trasferimento in successivi cicli di scongelamento consente da un lato di limitare il numero di embrioni freschi trasferiti per singolo transfer, riducendo drasticamente il rischio di impianti multipli, dall'altro di incrementare considerevolmente le probabilità di ottenere una gravidanza per ogni ciclo di stimolazione.

Il metodo convenzionale per la crioconservazione di embrioni è noto come “controlled rate freezing”, o “congelamento lento”. L'embrione è posto a contatto con soluzioni contenenti sostanze definite “crioprotettori”, che deidratano l'ambiente cellulare e riducono il rischio di danno cellulare derivante dalla formazione intracellulare di cristalli di ghiaccio durante il successivo abbassamento di temperatura. Attraverso l'impiego di un cryofreezer programmabile, l'embrione viene poi portato molto lentamente a temperature sempre più basse, fino a raggiungere i 40 gradi centigradi sotto lo zero; al di sotto di questa temperatura è possibile raffreddare rapidamente fino a valori vicini a quelli dell'azoto liquido, non sussistendo più il rischio di formazione di ghiaccio intracellulare.
Una volta trasferito in azoto liquido, l'embrione può essere conservato per un periodo anche molto lungo (risultano gravidanze da ovociti congelati da oltre 10 anni). Implicazioni di natura etica possono rendere la crioconservazione di embrioni difficile da accettare, oppure normative come la nostra Legge 40 del 2004 possono renderla inattuabile. L'ovvia alternativa è quella di crioconservare gli ovociti.

Le prime esperienze
Le prime gravidanze ottenute da ovociti crioconservati sono state ottenute già più di un ventennio fa (Chen, 1986; Al-Hasani et al., 1987). Si trattava però di eventi episodici e l’efficienza della tecnica era enormemente più bassa della crioconservazione degli embrioni. Non solo per gli esseri umani: nel 1977, Whittingham aveva ottenuto percentuali di fecondazione in ovociti di topo crioconservati molto ridotte. I risultati erano stati anche confermati nel 1989 da Carroll (Carroll et al., 1989), che riportava importanti alterazioni del processo di fecondazione (come la mancata estrusione del secondo globulo polare). Andava sempre più diffondendosi, quindi, la consapevolezza che gli ovociti fossero una specie cellulare scarsamente resistente alla crioconservazione.
Inizialmente le possibili ragioni furono comprese solo in parte e si consolidò l’idea che le grandi dimensioni della cellula (che limitano l'effetto deidratante dei crioprotettori) e l’elevata sensibilità del citoscheletro alle basse temperature costituissero difficoltà quasi insormontabili. Così, sia in campo clinico sia in ambito sperimentale, la crioconservazione di ovociti fu dimenticata per circa un decennio, anche per l'elevata efficacia garantita della crioconservazione di embrioni e la scarsità di ovociti umani da destinare alla ricerca.

L'evoluzione della ricerca
Nella seconda metà degli anni Novanta si è assistito a un rinnovamento dell’interesse verso la crioconservazione degli ovociti. Nel 1997 Eleonora Porcu (Porcu et al.,1997) riportava il completamento di una gravidanza ottenuta da un ovocita crioconservato, un risultato clinico che seguiva di pochi anni altri importanti progressi in campo sperimentale. Nel 1993, Carroll (Carroll et al.,1993) dimostrava che, attraverso opportune modifiche del protocollo di congelamento lento, era possibile ottenere in ovociti di topo crioconservati percentuali di fecondazione e sviluppo pre e post-impianto sovrapponibili a quelle normalmente ottenute con ovociti freschi. Veniva così sfatato il pregiudizio che gli ovociti di mammifero non fossero crioconservabili in maniera efficiente. È facile immaginare quanto questo risultato abbia incoraggiato nuovi studi nella specie umana, pur considerate le ovvie differenze (prima fra tutte le dimensioni) esistenti tra ovociti murini e umani. Le prime esperienze sistematiche sul congelamento di ovociti umani sono state condotte da Gook e collaboratori: i loro studi confermavano il noto problema della scarsa percentuale di sopravvivenza dopo scongelamento (Gook et al., 1994), tuttavia dimostravano la possibilità di crioconservare gli ovociti senza danneggiare il fuso meiotico, la struttura subcellulare che presiede alla segregazione dei cromosomi (Gook et al., 1993).
Tra la fine degli anni Novanta e l'inizio del successivo decennio sono state pubblicate diverse esperienze nella crioconservazione degli ovociti (Polak de Fried et al., 1998; Tucker et al., 1998; Young et al., 1998, per citarne alcune); ancora una volta, però, questi studi avevano un carattere episodico per via della mancanza di un serio approccio metodologico. Emblematico in tal senso è lo studio di Tucker, in cui è stato adottato un protocollo di crioconservazione obsoleto e ovociti inadeguati alle finalità dell'indagine, cioè immaturi (allo stato di vescicola germinale) o invecchiati in vitro prima di essere utilizzati.
 
I nostri primi studi
La bassa efficienza del metodo di crioconservazione convenzionale, concepito in origine per gli embrioni allo stadio di 2-4 cellule, è stata confermata anche dal nostro gruppo, con esperienze che risalgono al 1996: quando la crioconservazione di ovociti era applicata in maniera sporadica, noi avevamo già utilizzato gli ovociti crioconservati di 32 pazienti, ottenendo una percentuale di gravidanza per transfer del 17 per cento (Borini et al., 1998). Un nostro studio sistematico, pubblicato nel 2004 (Borini et al., 2004), ha dimostrato che la crioconservazione eseguita secondo il metodo tradizionale incide negativamente sia sulle percentuali di sopravvivenza, sia su quelle di fecondazione. In maniera però inaspettata, dai nostri dati è emerso anche che, alle condizioni applicate, gli embrioni derivanti da ovociti crioconservati avevano una capacità di impianto relativamente elevata, tanto da generare percentuali di gravidanza degne di attenzione.
Lo studio, svolto su 68 pazienti, per quanto non esaustivo ha avuto il merito di dimostrare che la crioconservazione di ovociti è un'opzione di trattamento riproducibile in maniera sistematica.
 
La ricerca e lo sviluppo di nuovi protocolli
Nel frattempo, la consapevolezza della necessità di nuovi protocolli di crioconservazione ha stimolato la ricerca di base. Nel 2001 è stata pubblicata l'importante osservazione secondo cui negli esseri umani la sopravvivenza ovocitaria post-scongelamento può essere considerevolmente aumentata (dal 35-40% al 70-75%) elevando la concentrazione del crioprotettore saccarosio nella miscela di crioconservazione (Fabbri et al., 2001). Nella specie murina si è anche osservato che, sostituendo il sodio con la colina (uno ione di pari carica elettrica, ma presumibilmente meno tossico), è possibile aumentare drasticamente le percentuali di sopravvivenza e fecondazione, insieme alla capacità di sviluppo pre e post-impianto (Stachecki et al., 1998). Questi progressi hanno stimolato ulteriori studi clinici che hanno confermato la possibilità di migliorare la resa della crioconservazione ovocitaria in termini di sopravvivenza, capacità di fecondazione e sviluppo (Boldt et al., 2003; Fosas et al., 2003). I loro risultati, però, non possono essere ritenuti clinicamente validi, dal momento che gli studi sono stati compiuti su un numero troppo esiguo di pazienti (meno di 15-20).
Altro studio interessante è quello di Chen (Chen et al., 2005), che riporta l'esito di venti cicli di congelamento-scongelamento eseguiti con il metodo descritto alcuni anni prima (Fabbri et al., 2001). Chen è riuscito ad ottenere elevate percentuali di sopravvivenza (75%), fecondazione (67%) e impianto (11%). Secondo un suo calcolo, inoltre, per ogni cento ovociti scongelati sarebbe possibile ottenere circa cinque impianti. Un numero non di poco conto se si considera che, nel caso degli embrioni congelati, da 100 ovociti freschi di norma si ottengono circa quattro impianti (Gook and Edgar, 1999).
Tuttavia, un nostro recente studio in cui è stato utilizzato lo stesso metodo di crioconservazione (Borini et al., 2006) non ha confermato questo dato: alte percentuali di sopravvivenza (74%), fecondazione (76%) e divisione degli ovociti fecondati (90%) infatti, sono state accompagnate percentuali di impianto deludenti (5%). Calcolando poi la percentuale di impianto rispetto a cento ovociti scongelati, è emerso un valore  alquanto modesto (2,6%). Questo ha messo in discussione la riproducibilità dei dati di Chen, sebbene sia importante sottolineare che le percentuali di impianto dei due studi non sono direttamente confrontabili (nel nostro caso era preclusa, per via della Legge 40 del 2004, la possibilità di generare più di tre embrioni e, pertanto, di selezionare gli embrioni da trasferire, possibilità sistematicamente sfruttata nello studio di Chen). Ciò nonostante, siamo del parere che i nostri dati siano più attendibili, perché riferiti a un numero dieci volte maggiore di scongelamenti (201). Inoltre, i risultati di uno studio concomitante di un altro gruppo italiano (Levi Setti et al., 2006), basato su un numero altrettanto elevato di pazienti (159), sono in perfetta coerenza con i nostri.
 
I nostri dati più recenti
Nel 2007 abbiamo ripetuto l'esperienza del 2006 su un numero maggiore di pazienti, confermando quanto già osservato.
Il motivo per cui, ovociti che sopravvivono con alte percentuali al congelamento - e sostengono il processo di fecondazione e divisione in maniera apparentemente normale - non siano poi in grado di dar luogo a una gravidanza evolutiva non è ancora completamente compreso. Recentemente abbiamo cercato di fornire una possibile spiegazione a questa apparente incoerenza con studi di base sulla crioconservazione degli ovociti.
Nel caso particolare del protocollo impiegato nel nostro studio del 2006, attraverso ricerche di microscopia elettronica, abbiamo accertato che, sebbene gli ovociti sopravvivano apparentemente intatti alla crioconservazione, in realtà presentano importanti alterazioni dell'organizzazione cellulare interna, non visibili attraverso la microscopia convenzionale usata di routine nel laboratorio di PMA (Nottola et al., 2006). È difficile sostenere con certezza una relazione di causa-effetto tra le lesioni cellulari e la compromessa capacità di impianto, tuttavia l'associazione è alquanto suggestiva. Inoltre, attraverso tecniche di microscopia confocale, abbiamo appurato che la tanto temuta distruzione del fuso meiotico, ossia della struttura citoscheletrica che segrega i cromosomi e la cui disfunzione genera aneuploidie nell'embrione, in realtà non si verifica, almeno alle condizioni da noi controllate (Coticchio et al., 2006). Ciò mette in discussione la tesi secondo cui il fuso meiotico, una volta esposto a basse temperature, vada inevitabilmente incontro a danni irreparabili.
 
La vitrificazione
Negli ultimi anni è cominciata la sperimentazione di un metodo alternativo di crioconservazione, noto come vitrificazione. Invece che deidratare e abbassare lentamente la temperatura per impedire la formazione di ghiaccio intracellulare, si applicano transizioni di temperatura estremamente più rapide, con lo scopo di non lasciar tempo alle molecole d'acqua di organizzarsi in un reticolo cristallino e prevenendo la formazione di ghiaccio intra o extra-cellulare.
Per aumentare la viscosità della soluzione di vitrificazione e ostacolare ulteriormente la formazione di ghiaccio, si impiegano concentrazioni di crioprotettore molto più elevate rispetto al congelamento lento (fino a 4 o 5 volte). Ciò, però, comporta un elevato rischio di tossicità, che costituisce uno degli aspetti più problematici di questo metodo.
Il protocollo adottato già da tempo in campo biotecnologico-zootecnico è stato applicato in alcuni casi per la crioconservazione di ovociti umani. Attualmente gli studi clinici pubblicati sull'argomento sono esigui (Yoon et al., 2003; Kuwayama et al., 2005; Lucena et al., 2006), mentre le gravidanze descritte in articoli scientifici (peer-reviewed papers) sono state complessivamente poco più di trenta.
Numericamente questi dati sono ancora pochi e pertanto non paragonabili a quelli riguardanti i vari protocolli di congelamento lento. Per questa ragione, almeno per ora, a nostro avviso l'ottimismo sorto intorno alla vitrificazione, alimentato da alcuni ambienti scientifici (Kuleshova and Lopata, 2002) e dai media, è prematuro.
In qualsiasi ambito medico-scientifico, l'efficacia di una tecnica è stimabile a patto che i casi studiati siano numericamente consistenti e che i risultati siano riproducibili, circostanze che non appaiono attualmente riscontrabili nella vitrificazione degli ovociti. Naturalmente ogni tentativo di progresso in materia va incondizionatamente incoraggiato, ma appare razionalmente infondata l'opinione secondo cui la vitrificazione costituisca già, allo stato attuale, la soluzione al problema della crioconservazione di ovociti.
 
Il nuovo protocollo di congelamento lento utilizzato da Tecnobios Procreazione
In seguito a una serie di osservazioni sull'azione dei crioprotettori e sulle relative reazioni cellulari indotte negli ovociti (Paynter et al., 2005), abbiamo recentemente identificato un protocollo di crioconservazione alternativo (Bianchi et al., 2007). Il metodo è stato verificato su una prima serie piuttosto numerosa di cicli di scongelamento (90).
In termini di frequenze di sopravvivenza, fecondazione e divisione, gli ovociti crioconservati con questo metodo hanno dato risultati del tutto comparabili a quelli ottenuti nello studio del 2006 (Borini et al., 2006): rispettivamente, il 76%, il 76% e il 93%. Appare notevolmente migliorata, invece, la capacità di impianto, che ha dato frequenze di successo superiori al 13%. Questo permetterebbe di ottenere circa 6-7 impianti per cento ovociti scongelati, valore ben maggiore rispetto al 2,4-2,6% dei precedenti protocolli (Borini et al., 2004; Borini et al., 2006).

Naturalmente si tratta di dati preliminari, per quanto comunque numericamente più consistenti rispetto alla grande maggioranza di quelli presentati nelle altre pubblicazioni sul congelamento lento. Per confermare i risultati, comunque, sarà necessario applicare il nuovo protocollo a un numero maggiore di pazienti, selezionate secondo criteri che garantiscano l'attendibilità e la chiara interpretazione dell'esito clinico. E, soprattutto, questi risultati dovranno essere verificati in maniera indipendente da altri gruppi di ricerca, che ne confermino la riproducibilità.

di Carlo Flamigni

Il timore che le tecniche di fecondazione assistita facciano nascere un maggior numero di feti imperfetti rispetto all'incidenza delle malconformazioni congenite che si osserva nella natalità spontanea ha certamente basi teoriche. La manipolazione dei gameti potrebbe indurre anomalie cromosomiche; ci potrebbe essere un aumento di fertilizzazioni da parte di spermatozoi anomali; si potrebbero determinare mutazioni geniche; i terreni di coltura e le sostanze usate in laboratorio potrebbero avere effetti teratogeni. Le preoccupazioni aumentano quando si prende in esame la ICSI e quando vengono utilizzate tecniche che si basano sul prelievo di spermatozoi non completamente maturi, come quelli prelevati dal testicolo e dall'epididimo (TESA e PESA). Della tecnica di fecondazione in vitro ICSI si è temuto soprattutto il prelievo casuale dello spermatozoo che deve essere iniettato nell'ovocita, ma le preoccupazioni si sono oggi accentrate sul fatto che, con questa tecnica, riescono ad avere figli uomini affetti da sterilità genetica, che potrebbero trasmettere ai figli il loro stesso problema, se non addirittura anomalie genetiche più gravi. Le preoccupazioni che riguardano l'uso di spermatozoi immaturi sono giustificate dal timore di una incompleta inattivazione di geni atipici. Ulteriori preoccupazioni vengono alimentate dalle proposte di applicare tecniche assolutamente sperimentali (si pensi alla possibile utilizzazione di spermatidi in assenza di spermatozoi), e sono ancora considerate con molte perplessità la crioconservazione dei gameti, in particolare di quelli femminili, e la biopsia embrionale eseguita per indagini genetiche.

Valutare l'incidenza delle anomalie congenite è facile solo in teoria. Il primo problema e la prima difficoltà hanno inizio quando si cerca la falsariga sulla quale valutare i dati, cioè l'incidenza delle anomalie congenite nella popolazione generale. Esistono inoltre malconformazioni che vengono diagnosticate solo quando viene raggiunta l'età riproduttiva e altre di cui ci si rende conto solo casualmente. Primo problema dunque: di quali dati tenere conto e con quali altri dati confrontarli?

I bambini nati dopo l'applicazione di una qualsiasi tecnica di procreazione assistita vengono generalmente presi in esame con grande scrupolo, ed è difficile che una malconformazione maggiore sfugga al medico che li esamina alla nascita, cosa che non si può dire per gli altri bambini. C'è poi un po' di confusione nella classificazione delle anomalie congenite, e non tutti considerano nello stesso modo le malconformazioni "maggiori" e quelle "minori". Ne deriva una complessiva difficoltà quando si voglia chiarire alla coppia se un aumento di rischio esiste realmente o no.
Vero è anche che le tecniche di fecondazione in vitro vengono eseguite su donne che hanno spesso caratteristiche e storie particolari e che ciò, insieme al grande numero di gravidanze multiple, è causa di una maggior incidenza di malconformazioni rispetto ai dati dei registri nazionali, con i quali dunque non è proponibile un raffronto.

Al termine di una lettura piuttosto impegnativa su questo argomento (la letteratura medica esistente su questo tema è molto vasta) non posso dire di essermi fatto un parere chiaro e definitivo. Ritengo di poter affermare che, se un rischio esiste, si deve trattare di un rischio minimo, altrimenti sarebbe ormai emerso con chiarezza; ritengo che i dati relativi alla prevalenza di una patologia, così discordanti, non possano che confermare questo giudizio. Debbo accettare la critica di chi accusa i medici che operano in questo settore di aver messo da parte troppo presto i loro timori: le conseguenze a lungo termine delle modificazioni epigenetiche dell'espressione dei geni sono state finora verificate solo negli animali come risultato dell'impiego delle tecnologie riproduttive, ma secondo alcuni genetisti il tempo potrebbe riservare sorprese anche per quanto riguarda l'uomo. Sembra più una maledizione che una previsione scientifica, ma deve naturalmente imporre a tutti un comportamento prudente e una vigilanza assidua.
Il gruppo che ha certamente la maggior esperienza nel campo della ICSI, quello belga di Van Steirteghem, ha pubblicato nel 2002 un articolo nel quale lamenta la scarsa attenzione dei medici nei riguardi delle anomalie cromosomiche osservate nei "bambini ICSI". Gli autori sottolineano, con molta onestà, i motivi delle preoccupazioni esistenti nei riguardi delle microiniezioni: il procedimento iniettivo, certamente invasivo;
l'empirismo con il quale si seleziona lo spermatozoo che sarà iniettato;
il fatto che una piccola quantità del mezzo di coltura venga iniettato nell'ooplasma;
il fatto che si ottenga una fertilizzazione con un liquido seminale che non avrebbe mai potuto essere altrimenti utilizzato con successo. La conclusione è, comunque, solo in parte tranquillizzante; il rischio è piccolo, ma esiste e riguarda un aumento delle aneuploidie dei cromosomi sessuali e delle anomalie autosomiche de novo. Circa le anomalie cromosomiche strutturali, esse risultano prevalentemente ereditate dal padre, cosa non sorprendente se si considera la frequenza con la quale queste alterazioni sono presenti negli uomini gravemente dispermici.
 
C'è quindi un'indicazione – già seguita dalla maggior parte dei centri – ad eseguire esami genetici completi negli uomini sterili e a controllare la normalità dei bambini con le opportune indagini prenatali. C'è una critica, in via di massima già respinta, ai medici che pubblicano casistiche sulla ICSI, a considerare la gravità delle malconformazioni secondo criteri ufficiali, tralasciando giudizi personali, generalmente un po' troppo superficiali. C'è il riconoscimento della scarsissima importanza numerica di gran parte delle sindromi più o meno correttamente associate alla ICSI. E c'è – e la condivido pienamente - una sollecitazione agli operatori e ai tecnici di cercare di arrivare il più presto possibile al trasferimento di un solo embrione, in modo da evitare la patologia associata alle gravidanze multiple e alla riduzione delle camere embrionali, fonte di patologie molto più importanti, sul piano pratico, di quelle che "potrebbero" avere origine dalle ICSI. Conclusioni, a mio avviso, piene di buon senso, come è certamente un auspicio dettato dal buon senso quello di non ignorare le patologie associate alle tecniche di fecondazione assistita solo perchè statisticamente insignificanti.
Mi sembra che la fecondazione in vitro non rappresenti un rischio significativo per i nuovi nati, e ho la sensazione che quello che ancora resta da chiarire non possa rappresentare un fantasma tale da spaventare le coppie e i medici. Questo non vuol dire che sia giusto ignorare i problemi, anche i più insignificanti, e mi associo al coro di chi chiede che su tutti i bambini nati da tecniche di fecondazione artificiale venga eseguito un controllo a lungo termine.
 
Per quanto riguarda la ICSI, emerge invece la necessità di capire qualcosa di più sull'associazione tra cause genetiche di oligospermia severa e d'azoospermia e possibilità di malconformazioni e di malattie congenite nei bambini. Questa è comunque, oggi, l'opinione più diffusa: che i rischi esistano, che siano statisticamente modesti, che non dipendano dalla tecnica di per sè ma dal fatto che essa venga frequentemente utilizzata in casi di sterilità maschile con specifiche implicazioni genetiche. Questo comune convincimento sta modificando l'analisi dei risultati, sempre più riservata a gruppi assimilabili per il tipo di indicazione e sta rafforzando l'idea di considerare la ICSI come una tecnica residuale, da usare solo in casi selezionati, quelli in cui è realmente indispensabile.

Mi sembra che il dubbio più importante derivi dal sospetto che la ICSI possa provocare modificazioni epigenetiche, cause possibili di un alterato sviluppo del feto; non può poi essere esclusa l'ipotesi di una interazione tra modificazioni epigenetiche e altri percorsi patologici indotti dallo stress. I timori che ne derivano non possono essere considerati così importanti da imporre limitazioni all'uso della tecnica e mi sembra francamente esagerato continuare a considerarla sperimentale. Mi sembra invece logico mantenere sotto discreto controllo i bambini che grazie a questa tecnica di procreazione assistita sono nati, almeno fino a quando diventeranno adulti. (www.carloflamigni.it)