Tecnobios

Studi sulla crioconservazione - La nostra esperienza

20 settembre 09 

Dalla crioconservazione degli embrioni alla crioconservazione degli ovociti
Nella normale prassi della PMA, la crioconservazione degli embrioni soprannumerari e il loro trasferimento in successivi cicli di scongelamento consente da un lato di limitare il numero di embrioni freschi trasferiti per singolo transfer, riducendo drasticamente il rischio di impianti multipli, dall'altro di incrementare considerevolmente le probabilità di ottenere una gravidanza per ogni ciclo di stimolazione.

Il metodo convenzionale per la crioconservazione di embrioni è noto come “controlled rate freezing”, o “congelamento lento”. L'embrione è posto a contatto con soluzioni contenenti sostanze definite “crioprotettori”, che deidratano l'ambiente cellulare e riducono il rischio di danno cellulare derivante dalla formazione intracellulare di cristalli di ghiaccio durante il successivo abbassamento di temperatura. Attraverso l'impiego di un cryofreezer programmabile, l'embrione viene poi portato molto lentamente a temperature sempre più basse, fino a raggiungere i 40 gradi centigradi sotto lo zero; al di sotto di questa temperatura è possibile raffreddare rapidamente fino a valori vicini a quelli dell'azoto liquido, non sussistendo più il rischio di formazione di ghiaccio intracellulare.
Una volta trasferito in azoto liquido, l'embrione può essere conservato per un periodo anche molto lungo (risultano gravidanze da ovociti congelati da oltre 10 anni). Implicazioni di natura etica possono rendere la crioconservazione di embrioni difficile da accettare, oppure normative come la nostra Legge 40 del 2004 possono renderla inattuabile. L'ovvia alternativa è quella di crioconservare gli ovociti.

Le prime esperienze

Le prime gravidanze ottenute da ovociti crioconservati sono state ottenute già più di un ventennio fa (Chen, 1986; Al-Hasani et al., 1987). Si trattava però di eventi episodici e l’efficienza della tecnica era enormemente più bassa della crioconservazione degli embrioni. Non solo per gli esseri umani: nel 1977, Whittingham aveva ottenuto percentuali di fecondazione in ovociti di topo crioconservati molto ridotte. I risultati erano stati anche confermati nel 1989 da Carroll (Carroll et al., 1989), che riportava importanti alterazioni del processo di fecondazione (come la mancata estrusione del secondo globulo polare). Andava sempre più diffondendosi, quindi, la consapevolezza che gli ovociti fossero una specie cellulare scarsamente resistente alla crioconservazione.
Inizialmente le possibili ragioni furono comprese solo in parte e si consolidò l’idea che le grandi dimensioni della cellula (che limitano l'effetto deidratante dei crioprotettori) e l’elevata sensibilità del citoscheletro alle basse temperature costituissero difficoltà quasi insormontabili. Così, sia in campo clinico sia in ambito sperimentale, la crioconservazione di ovociti fu dimenticata per circa un decennio, anche per l'elevata efficacia garantita della crioconservazione di embrioni e la scarsità di ovociti umani da destinare alla ricerca.

L'evoluzione della ricerca
Nella seconda metà degli anni Novanta si è assistito a un rinnovamento dell’interesse verso la crioconservazione degli ovociti. Nel 1997 Eleonora Porcu (Porcu et al.,1997) riportava il completamento di una gravidanza ottenuta da un ovocita crioconservato, un risultato clinico che seguiva di pochi anni altri importanti progressi in campo sperimentale. Nel 1993, Carroll (Carroll et al.,1993) dimostrava che, attraverso opportune modifiche del protocollo di congelamento lento, era possibile ottenere in ovociti di topo crioconservati percentuali di fecondazione e sviluppo pre e post-impianto sovrapponibili a quelle normalmente ottenute con ovociti freschi. Veniva così sfatato il pregiudizio che gli ovociti di mammifero non fossero crioconservabili in maniera efficiente. È facile immaginare quanto questo risultato abbia incoraggiato nuovi studi nella specie umana, pur considerate le ovvie differenze (prima fra tutte le dimensioni) esistenti tra ovociti murini e umani. Le prime esperienze sistematiche sul congelamento di ovociti umani sono state condotte da Gook e collaboratori: i loro studi confermavano il noto problema della scarsa percentuale di sopravvivenza dopo scongelamento (Gook et al., 1994), tuttavia dimostravano la possibilità di crioconservare gli ovociti senza danneggiare il fuso meiotico, la struttura subcellulare che presiede alla segregazione dei cromosomi (Gook et al., 1993).
Tra la fine degli anni Novanta e l'inizio del successivo decennio sono state pubblicate diverse esperienze nella crioconservazione degli ovociti (Polak de Fried et al., 1998; Tucker et al., 1998; Young et al., 1998, per citarne alcune); ancora una volta, però, questi studi avevano un carattere episodico per via della mancanza di un serio approccio metodologico. Emblematico in tal senso è lo studio di Tucker, in cui è stato adottato un protocollo di crioconservazione obsoleto e ovociti inadeguati alle finalità dell'indagine, cioè immaturi (allo stato di vescicola germinale) o invecchiati in vitro prima di essere utilizzati.
 
I nostri primi studi
La bassa efficienza del metodo di crioconservazione convenzionale, concepito in origine per gli embrioni allo stadio di 2-4 cellule, è stata confermata anche dal nostro gruppo, con esperienze che risalgono al 1996: quando la crioconservazione di ovociti era applicata in maniera sporadica, noi avevamo già utilizzato gli ovociti crioconservati di 32 pazienti, ottenendo una percentuale di gravidanza per transfer del 17 per cento (Borini et al., 1998). Un nostro studio sistematico, pubblicato nel 2004 (Borini et al., 2004), ha dimostrato che la crioconservazione eseguita secondo il metodo tradizionale incide negativamente sia sulle percentuali di sopravvivenza, sia su quelle di fecondazione. In maniera però inaspettata, dai nostri dati è emerso anche che, alle condizioni applicate, gli embrioni derivanti da ovociti crioconservati avevano una capacità di impianto relativamente elevata, tanto da generare percentuali di gravidanza degne di attenzione.
Lo studio, svolto su 68 pazienti, per quanto non esaustivo ha avuto il merito di dimostrare che la crioconservazione di ovociti è un'opzione di trattamento riproducibile in maniera sistematica.
 
La ricerca e lo sviluppo di nuovi protocolli

Nel frattempo, la consapevolezza della necessità di nuovi protocolli di crioconservazione ha stimolato la ricerca di base. Nel 2001 è stata pubblicata l'importante osservazione secondo cui negli esseri umani la sopravvivenza ovocitaria post-scongelamento può essere considerevolmente aumentata (dal 35-40% al 70-75%) elevando la concentrazione del crioprotettore saccarosio nella miscela di crioconservazione (Fabbri et al., 2001). Nella specie murina si è anche osservato che, sostituendo il sodio con la colina (uno ione di pari carica elettrica, ma presumibilmente meno tossico), è possibile aumentare drasticamente le percentuali di sopravvivenza e fecondazione, insieme alla capacità di sviluppo pre e post-impianto (Stachecki et al., 1998). Questi progressi hanno stimolato ulteriori studi clinici che hanno confermato la possibilità di migliorare la resa della crioconservazione ovocitaria in termini di sopravvivenza, capacità di fecondazione e sviluppo (Boldt et al., 2003; Fosas et al., 2003). I loro risultati, però, non possono essere ritenuti clinicamente validi, dal momento che gli studi sono stati compiuti su un numero troppo esiguo di pazienti (meno di 15-20).
Altro studio interessante è quello di Chen (Chen et al., 2005), che riporta l'esito di venti cicli di congelamento-scongelamento eseguiti con il metodo descritto alcuni anni prima (Fabbri et al., 2001). Chen è riuscito ad ottenere elevate percentuali di sopravvivenza (75%), fecondazione (67%) e impianto (11%). Secondo un suo calcolo, inoltre, per ogni cento ovociti scongelati sarebbe possibile ottenere circa cinque impianti. Un numero non di poco conto se si considera che, nel caso degli embrioni congelati, da 100 ovociti freschi di norma si ottengono circa quattro impianti (Gook and Edgar, 1999).
Tuttavia, un nostro recente studio in cui è stato utilizzato lo stesso metodo di crioconservazione (Borini et al., 2006) non ha confermato questo dato: alte percentuali di sopravvivenza (74%), fecondazione (76%) e divisione degli ovociti fecondati (90%) infatti, sono state accompagnate percentuali di impianto deludenti (5%). Calcolando poi la percentuale di impianto rispetto a cento ovociti scongelati, è emerso un valore  alquanto modesto (2,6%). Questo ha messo in discussione la riproducibilità dei dati di Chen, sebbene sia importante sottolineare che le percentuali di impianto dei due studi non sono direttamente confrontabili (nel nostro caso era preclusa, per via della Legge 40 del 2004, la possibilità di generare più di tre embrioni e, pertanto, di selezionare gli embrioni da trasferire, possibilità sistematicamente sfruttata nello studio di Chen). Ciò nonostante, siamo del parere che i nostri dati siano più attendibili, perché riferiti a un numero dieci volte maggiore di scongelamenti (201). Inoltre, i risultati di uno studio concomitante di un altro gruppo italiano (Levi Setti et al., 2006), basato su un numero altrettanto elevato di pazienti (159), sono in perfetta coerenza con i nostri.
 
I nostri dati più recenti

Nel 2007 abbiamo ripetuto l'esperienza del 2006 su un numero maggiore di pazienti, confermando quanto già osservato.
Il motivo per cui, ovociti che sopravvivono con alte percentuali al congelamento - e sostengono il processo di fecondazione e divisione in maniera apparentemente normale - non siano poi in grado di dar luogo a una gravidanza evolutiva non è ancora completamente compreso. Recentemente abbiamo cercato di fornire una possibile spiegazione a questa apparente incoerenza con studi di base sulla crioconservazione degli ovociti.
Nel caso particolare del protocollo impiegato nel nostro studio del 2006, attraverso ricerche di microscopia elettronica, abbiamo accertato che, sebbene gli ovociti sopravvivano apparentemente intatti alla crioconservazione, in realtà presentano importanti alterazioni dell'organizzazione cellulare interna, non visibili attraverso la microscopia convenzionale usata di routine nel laboratorio di PMA (Nottola et al., 2006). È difficile sostenere con certezza una relazione di causa-effetto tra le lesioni cellulari e la compromessa capacità di impianto, tuttavia l'associazione è alquanto suggestiva. Inoltre, attraverso tecniche di microscopia confocale, abbiamo appurato che la tanto temuta distruzione del fuso meiotico, ossia della struttura citoscheletrica che segrega i cromosomi e la cui disfunzione genera aneuploidie nell'embrione, in realtà non si verifica, almeno alle condizioni da noi controllate (Coticchio et al., 2006). Ciò mette in discussione la tesi secondo cui il fuso meiotico, una volta esposto a basse temperature, vada inevitabilmente incontro a danni irreparabili.
 
La vitrificazione
Negli ultimi anni è cominciata la sperimentazione di un metodo alternativo di crioconservazione, noto come vitrificazione. Invece che deidratare e abbassare lentamente la temperatura per impedire la formazione di ghiaccio intracellulare, si applicano transizioni di temperatura estremamente più rapide, con lo scopo di non lasciar tempo alle molecole d'acqua di organizzarsi in un reticolo cristallino e prevenendo la formazione di ghiaccio intra o extra-cellulare.
Per aumentare la viscosità della soluzione di vitrificazione e ostacolare ulteriormente la formazione di ghiaccio, si impiegano concentrazioni di crioprotettore molto più elevate rispetto al congelamento lento (fino a 4 o 5 volte). Ciò, però, comporta un elevato rischio di tossicità, che costituisce uno degli aspetti più problematici di questo metodo.
Il protocollo adottato già da tempo in campo biotecnologico-zootecnico è stato applicato in alcuni casi per la crioconservazione di ovociti umani. Attualmente gli studi clinici pubblicati sull'argomento sono esigui (Yoon et al., 2003; Kuwayama et al., 2005; Lucena et al., 2006), mentre le gravidanze descritte in articoli scientifici (peer-reviewed papers) sono state complessivamente poco più di trenta.
Numericamente questi dati sono ancora pochi e pertanto non paragonabili a quelli riguardanti i vari protocolli di congelamento lento. Per questa ragione, almeno per ora, a nostro avviso l'ottimismo sorto intorno alla vitrificazione, alimentato da alcuni ambienti scientifici (Kuleshova and Lopata, 2002) e dai media, è prematuro.
In qualsiasi ambito medico-scientifico, l'efficacia di una tecnica è stimabile a patto che i casi studiati siano numericamente consistenti e che i risultati siano riproducibili, circostanze che non appaiono attualmente riscontrabili nella vitrificazione degli ovociti. Naturalmente ogni tentativo di progresso in materia va incondizionatamente incoraggiato, ma appare razionalmente infondata l'opinione secondo cui la vitrificazione costituisca già, allo stato attuale, la soluzione al problema della crioconservazione di ovociti.
 
Il nuovo protocollo di congelamento lento utilizzato da Tecnobios Procreazione

In seguito a una serie di osservazioni sull'azione dei crioprotettori e sulle relative reazioni cellulari indotte negli ovociti (Paynter et al., 2005), abbiamo recentemente identificato un protocollo di crioconservazione alternativo (Bianchi et al., 2007). Il metodo è stato verificato su una prima serie piuttosto numerosa di cicli di scongelamento (90).
In termini di frequenze di sopravvivenza, fecondazione e divisione, gli ovociti crioconservati con questo metodo hanno dato risultati del tutto comparabili a quelli ottenuti nello studio del 2006 (Borini et al., 2006): rispettivamente, il 76%, il 76% e il 93%. Appare notevolmente migliorata, invece, la capacità di impianto, che ha dato frequenze di successo superiori al 13%. Questo permetterebbe di ottenere circa 6-7 impianti per cento ovociti scongelati, valore ben maggiore rispetto al 2,4-2,6% dei precedenti protocolli (Borini et al., 2004; Borini et al., 2006).

Naturalmente si tratta di dati preliminari, per quanto comunque numericamente più consistenti rispetto alla grande maggioranza di quelli presentati nelle altre pubblicazioni sul congelamento lento. Per confermare i risultati, comunque, sarà necessario applicare il nuovo protocollo a un numero maggiore di pazienti, selezionate secondo criteri che garantiscano l'attendibilità e la chiara interpretazione dell'esito clinico. E, soprattutto, questi risultati dovranno essere verificati in maniera indipendente da altri gruppi di ricerca, che ne confermino la riproducibilità.


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